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烟草花叶病毒荧光定量RT-PCR试剂盒(探针法)图片
产品货号:
BTN15-4540
中文名称:
烟草花叶病毒荧光定量RT-PCR试剂盒(探针法)
英文名称:
Tobacco Mosaic Virus(TMV)Probe RT-PCR Kit
产品规格:
50T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本制品是以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的专门检测烟草花叶病毒的试剂盒。


草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)为RNA病毒,是烟草花叶病等的病原体,属于Tobamovirus群。烟草花叶病和番茄花叶病早为一般所了解。叶上出现花叶症状,生长陷于不良状态,叶常呈畸形。因此快速灵敏诊断具有重要意义。


  1. 即开即用,用户只需要提供样品RNA模板。
  2. 引物和探针经过优化,分析灵敏性高。
  3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
  4. 特异性高,引物和探针是根据烟草花叶病毒RNA高度保守区设计,不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。
  5. 既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5各数量级。
  6. 本制品足够50次20μL体系的探针法荧光定量RT-PCR反应。
  7. 本制品只能用于科研。



组分规格
探针法qRT-PCR缓冲液500μL
探针法qRT-PCR酶混合液100μL
荧光PCR专用模板稀释液1mL
烟草花叶病毒探针法qRT-PCR引物-探针混合液150μL
烟草花叶病毒RT-PCR阳性对照(1×107拷贝/μL)50μL

保存:-20℃,有效期一年。


一、稀释标准曲线样品
以101~106拷贝/μL这6个10倍稀释度为例,由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本制品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
  1. 标记6个离心管,分别为6,5,4,3,2,1。
  2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光RT-PCR专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
  3. 在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×106拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
  4. 换枪头,在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
  5. 换枪头,在4号管中加入5μL 1×105拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×104拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
  6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。


二、样品RNA的制备
  1. 如果有N个样品,最好设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。
  2. 用自选方法纯化样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒RNA提取试剂盒。


三、Probe qRT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
  1. 如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个RT-PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于RT-PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复,则标记N+4个RT-PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于RT-PCR阴性对照(用水做模板),1个用于RT-PCR阳性对照(直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
  2. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
    成分样品管
    N+2个
    RT-PCR
    阴性对照
    曲线样品管
    (1~6管)
    探针法qRT-PCR缓冲液各10μL10μL各10μL
    探针法qRT-PCR酶混合液各2μL2μL各2μL
    烟草花叶病毒RT-PCR引物-探针混合液各3μL3μL各3μL
    N+2个待测RNA样本各5μL不加不加
    超纯水不加5μL不加
    第6步所得标准曲线样品稀释液(1~6号)不加不加各5μL

  3. 盖上盖子后上机,按下面参数进行RT-PCR:
    过程温度时间
    逆转录50℃30min
    预变性95℃10min
    RT-PCR反应
    (45个循环)
    95℃15sec
    60℃1min(采集FAM通道的荧光信号)


四、数据处理
  1. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值,再推算出其浓度。
  2. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于35。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35~40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。




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